Poszukiwanie naturalnych inhibitorów aktywności glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych

Małgorzata Pleszczyńska¹, Adrian Wiater¹, Janusz Szczodrak¹, Teresa Bachanek²

Próchnica zębów jest wypadkową wielu zjawisk, jednak podstawowe znaczenie ma w tym procesie płytka nazębna, czyli skupisko bakterii pokrywających powierzchnię zęba, osadzonych w podłożu zbudowanym z polimerów pochodzenia bakteryjnego lub ślinowego. Z całej gamy mikroorganizmów zasiedlających jamę ustną, najbardziej zaangażowane w wywoływanie i rozwój próchnicy zębów są paciorkowce zmienne, głównie Streptococcus mutans i S. sobrinus (1). Ich szczególne znaczenie w patogenezie próchnicy wynika z faktu, że wykorzystując sacharozę wytwarzają zewnątrzkomórkowe, rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie wielocukry (dekstrany i mutany), budujące szkielet płytki nazębnej. Enzymy biorące udział w syntezie wymienionych glukanów – glukozylotransferazy (GTF, E.C. 2.4.1.5) są więc istotnym czynnikiem wirulencji paciorkowców zmiennych (2). Funkcje glukanów w płytce nazębnej wyznacza ich budowa. Lepki, nierozpuszczalny mutan (liniowy a(1,3) glukan) ułatwia adsorbowanie się bakterii do powierzchni szkliwa, doprowadza do wytworzenia stabilnego połączenia pomiędzy paciorkowcami a błoną nazębną, a także umożliwia agregację bakterii występujących w niezależnych łańcuchach. W ten sposób odpowiada za zwiększenie masy płytki i jej ścisłe połączenie ze szkliwem (3). Rozpuszczalny dekstran (rozgałęziony a(1,6) glukan) stanowi rezerwę węglowodanową dla dalszych przemian metabolicznych w sytuacji niedoboru cukru w pożywieniu (4).

W praktyce stosowane są różne czynniki hamujące rozwój płytki nazębnej. Działają one poprzez redukcję istniejącej płytki, ochronę przed powstawaniem nowej, selektywne hamowanie wzrostu bakterii próchnicotwórczych i hamowanie czynników wirulencji, np. produkcji kwasu mlekowego i syntezy glukanów (5). Mogą to być zarówno środki chemiczne, np. chlorheksydyna, jak i – w ostatnich latach znowu coraz szerzej wykorzystywane – preparaty naturalne, np. wyciągi roślinne.

Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu wybranych surowców zielarskich na aktywność glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych.

MATERIAŁ I METODY BADAŃ

Do badań użyto dwóch szczepów paciorkowców zmiennych, Streptococcus sobrinus DSMZ 20381 i Streptococcus mutans CAPM 6067. Hodowano je na podłożu płynnym z wyciągiem mózgowo-sercowym – BHI (BTL, Polska) w warunkach statycznych i w temperaturze 37°C, przez okres 18 godz. Po zakończeniu hodowli bakterie usuwano przez wirowanie, a uzyskany supernatant, w postaci pierwotnej lub zagęszczony na drodze ultrafiltracji, służył jako surowy preparat zewnątrzkomórkowych glukozylotransferaz.

Zbadano jaki wpływ na aktywność GTF-az mają następujące surowce zielarskie: ziele jemioły, skrzypu, glistnika, liść pokrzywy, porzeczki czarnej, orzecha włos- kiego, kłącze pięciornika, korzeń mydlnicy lekarskiej (Zakład Zielarski „Kawon-Hurt”, Gostyń), kora dębu, owoc dzikiej róży, kłącze tataraku, korzeń prawoślazu lekarskiego, liść szałwii i mięty pieprzowej, ziele macierzanki i tymianku (Zakład Przetwórstwa Zielarskiego „Herba-Lux”, Warszawa). Wymienione zioła zastosowano w postaci 4% wyciągu wodnego, a kłącze pięciornika dodatkowo w postaci liofilizowanego ekstraktu etanolowo-wodnego. Dla porównania jako inhibitora enzymów użyto również kwasu elagowego (Sigma-Aldrich, USA) w postaci dwóch pochodnych, sodowej i argininowej, które w przeciwieństwie do związku wyjściowego dobrze rozpuszczają się w wodzie (6).

Do oceny wpływu badanych substancji na ogólną aktywność glukozylotransferaz wykorzystano metodę opisaną przez Smitha i wsp. (7). Mieszaninę reagującą zawierającą 0,9 ml 0,25 M sacharozy w 0,2 M buforze potasowo-fosforanowym o pH 6,0, surowy preparat GTF-az, inhibitor w odpowiednim stężeniu oraz bufor fosforanowy w uzupełnieniu do całkowitej objętości 2 ml, inkubowano w temperaturze 37°C w czasie 60 minut. Po tym czasie, wobec odpowiednich kontroli, oznaczano stężenie cukrów redukujących metodą kolorymetryczną z odczynnikiem DNS (8). Jednostkę aktywności GTF-az (U) definiowano jako 1 mmol fruktozy uwolniony przez enzym z sacharozy w opisanych warunkach w czasie jednej minuty.

Zbadano również oddziaływanie ziół na aktywność enzymów odpowiedzialnych za syntezę nierozpuszczalnego w wodzie mutanu. Wykonano w tym celu oznaczenia turbidymetryczne (9): mieszanina reagująca zawierała 1 ml niezagęszczonego preparatu glukozylotransferaz S. sobrinus, 2 ml 6% roztworu sacharozy w 0,1 M buforze potasowo-fosforanowym o pH 6,0, odpowiednią ilość inhibitora (ekstrakt z pięciornika lub pochodne kwasu elagowego) oraz bufor w uzupełnieniu do całkowitej objętości 4 ml. Jako środek konserwujący zastosowano azydek sodu w stężeniu 0,01%. Mieszaninę inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji, zmętnienie utworzone przez powstający glukan mierzono wobec właściwych kontroli w spektrofotometrze (Cecil, Wielka Brytania)

To jest tylko fragment artykułu. Aby przeczytać całość, przejdź do Czytelni medycznej.